عصر کرد - ایسنا / پژوهشگران دانشگاه علوم پزشکی تهران یک پلتفرم تشخیصی مبتنی بر فناوری کریسپر با نام «HOMEBRED» توسعه دادند که با هدف تشخیص سریع و قابلحمل عوامل عفونی در انسان و دام و شناسایی برخی رونوشتهای سرطانزا طراحی شده است و میتواند در برخی کاربردها بدون نیاز به استخراج اسید نوکلئیک و با استفاده از ابزار سادهای مانند نور آبی دستی، نتیجه آزمایش را نشان دهد.
به نقل از علم خوان پژوهشگران یک پلتفرم تشخیصی مبتنی بر فناوری ویرایش ژن کریسپر (CRISPR) با نام «HOMEBRED» توسعه دادهاند که برای شناسایی طیفی از عوامل بیماریزا در انسان و دام و همچنین برخی نشانگرهای مولکولی سرطان طراحی شده است. این سامانه با امکان تحلیل نمونههای خام و ارائه خوانش بصری، میتواند مسیر توسعه ابزارهای تشخیصی قابلحمل و قابل استفاده در محیطهای کمبرخوردار از تجهیزات آزمایشگاهی را هموار کند. تشخیص سریع، حساس و دقیق بیماریهای عفونی و سرطان از چالشهای مهم حوزه سلامت به شمار میرود؛ چرا که روشهای متداول مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) با وجود حساسیت و اختصاصیت بالا، معمولاً به تجهیزات تخصصی، نیروی آموزشدیده و آزمایشگاههای مجهز نیاز دارند و همین موضوع میتواند استفاده از آنها را در محیطهای دور از آزمایشگاه یا مناطق دارای محدودیت زیرساختی دشوار کند.
در سالهای اخیر، سامانههای تشخیصی مبتنی بر کریسپر به عنوان یکی از مسیرهای نوین تشخیص مولکولی مورد توجه قرار گرفتهاند. در این میان، پژوهشگران در مطالعهای با معرفی پلتفرم HOMEBRED، تلاش کردهاند برخی محدودیتهای روشهای تشخیصی مبتنی بر CRISPR را با طراحی یک سامانه قابلحمل، ساده و مقاوم در برابر تغییرات توالی برطرف کنند.
بر اساس نتایج این مطالعه، HOMEBRED یک پلتفرم تشخیصی مبتنی بر سامانه SHERLOCK است که برای شناسایی ویروسها و باکتریها، تمایز سویههای واکسنی از سویههای میدانی و شناسایی نشانگرهای سرطان طراحی شده است. این سامانه با هدف استفاده در شرایط میدانی، امکان بررسی مستقیم نمونه بدون نیاز به استخراج اسیدهای نوکلئیک و مشاهده نتیجه بدون تجهیزات تخصصی آزمایشگاهی را فراهم میکند.
یکی از اجزای مهم این سامانه، ابزار محاسباتی «CaSilico» است که برای طراحی خودکار RNAهای راهنما یا crRNA به کار میرود. این ابزار با شناسایی نواحی حفاظتشده در ژنوم عوامل بیماریزا، تلاش میکند محلهایی را برای هدفگیری انتخاب کند که در برابر تغییرات ژنتیکی مقاومت بیشتری داشته باشند. پژوهشگران با استفاده از این رویکرد، امکان شناسایی عوامل بیماریزا را در طیف متنوعی از نمونهها بررسی کردند.
در این مطالعه، عملکرد HOMEBRED برای شناسایی سه عامل عفونی شامل ویروس عامل بیماری تب برفکی، باکتری بروسلا و ویروس SARS-CoV-2 و همچنین رونوشتهای همجوشی BCR-ABL1 که از نشانگرهای مهم لوسمی میلوئید مزمن هستند، ارزیابی شد.
در بخش مربوط به SARS-CoV-2، پژوهشگران توالیهای مورد استفاده در سامانه را با استفاده از یک هزار و ۳۷۴ ژنوم کامل مربوط به نمونههای ایرانی بررسی کردند. بر اساس نتایج این تحلیل، توالی crRNA در ۹۹.۴۲ درصد ژنومها کاملاً حفاظتشده بود و آغازگرهای RPA نیز امکان تکثیر ۹۸.۹۱ درصد از ژنومهای بررسیشده را داشتند.
سپس عملکرد سامانه با هشت نمونه بالینی افراد دارای علائم بررسی شد. HOMEBRED در مقایسه با نتایج RT-qPCR، پنج نمونه مثبت و سه نمونه منفی را بهدرستی شناسایی کرد و میان نتایج این دو روش، تطابق کیفی کامل مشاهده شد.
تشخیص تب برفکی در نمونههای حیوانی
یکی از کاربردهای مهم HOMEBRED، تشخیص ویروس بیماری تب برفکی (FMDV) بود؛ بیماری ویروسی بسیار مسری که دامها را درگیر میکند و تشخیص سریع آن در کنترل بیماری اهمیت دارد. پژوهشگران برای طراحی RNAهای راهنما، ۷۰۷ توالی مربوط به ژن 3D ویروس تب برفکی از سروتیپهای مختلف را بررسی کردند و نواحی حفاظتشده این ژن را برای طراحی اهداف تشخیصی مورد استفاده قرار دادند. پس از بهینهسازی ساختار crRNA، عملکرد سامانه روی ۱۱ نمونه بالینی مربوط به سروتیپهای مختلف ویروس و همچنین نمونههای O و A بررسی شد.
نتایج نشان داد این روش توانست تمام نمونههای مثبت و منفی را مطابق نتایج RT-qPCR شناسایی کند. همچنین نتایج حاصل از خوانش فلورسنت و نوار جریان جانبی نیز با یکدیگر مطابقت داشتند.
از دیگر ویژگیهای مورد بررسی، توانایی سامانه برای تشخیص ویروس از نمونههای حیوانی بدون انجام فرآیند متداول استخراج اسید نوکلئیک بود. پژوهشگران با ترکیب HOMEBRED با روشی موسوم به HUDSON، نمونههای مربوط به ویروس تب برفکی را آمادهسازی و آزمایش کردند و توانستند در نمونههای خام، ویروس را با خوانش رنگسنجی و فلورسنت شناسایی کنند. بر اساس گزارش مقاله، حد تشخیص در این شرایط به ۳.۲۳×۱۰³ واحد تشکیلدهنده پلاک در هر میلیلیتر برای خوانش فلورسنت رسید.
پژوهشگران همچنین مقاومت سامانه در برابر تغییرات ژنتیکی را بررسی کردند. نتایج توالییابی نشان داد RNA راهنمای طراحیشده در نمونههای مختلف حفظ شده بود و حتی در یکی از نمونهها که یک تغییر تکنوکلئوتیدی در ناحیه هدف مشاهده شد، HOMEBRED همچنان توانست هدف مورد نظر را شناسایی کند.
تمایز سویه واکسنی بروسلا از سویههای میدانی
کاربرد دیگر HOMEBRED به تشخیص بروسلا اختصاص داشت. یکی از چالشهای تشخیص بروسلوز، تمایز حیوانات آلوده از حیوانات واکسینهشده است؛ زیرا ناتوانی در این تفکیک میتواند در برخی شرایط به حذف غیرضروری دامها، بهویژه دامهای دارای ارزش ژنتیکی بالا، منجر شود.
پژوهشگران برای رفع این مشکل، معماری دوگانهای از crRNAها طراحی کردند؛ بهگونهای که یک RNA راهنما برای شناسایی گونههای اصلی بروسلا و RNA راهنمای دیگر برای تمایز سویه واکسنی RB51 از سویههای میدانی مورد استفاده قرار گرفت.
در آزمایش روی ۱۴ نمونه شامل کشتهای باکتریایی و نمونههای بالینی مثبت و منفی، HOMEBRED توانست با نتایج روشهای PCR و qPCR تطابق کیفی کامل داشته باشد. همچنین سامانه توانست سویه واکسنی RB51 را از سایر سویههای مورد بررسی متمایز کند.
پژوهشگران نسخه تکمرحلهای این آزمون را نیز برای بروسلا ارزیابی کردند. این روش توانست تمام نمونههای مثبت و منفی را مطابق آزمون دومرحلهای شناسایی کند و در تمایز سویه واکسنی از سایر سویهها نیز تطابق کامل نشان داد.
شناسایی نشانگر مولکولی سرطان خون
پژوهشگران در بخش دیگری از مطالعه، قابلیت HOMEBRED برای شناسایی رونوشتهای همجوشی BCR-ABL1 را بررسی کردند. این رونوشتها از نشانگرهای مهم لوسمی میلوئید مزمن هستند و به دلیل وجود گونههای مختلف این رونوشت، تشخیص دقیق آنها میتواند در ارزیابی مولکولی بیماری اهمیت داشته باشد.
در این بخش، سامانه برای شناسایی رونوشتهای e13a2، e14a2 و e1a2 طراحی شد. بررسی نمونههای بالینی نشان داد HOMEBRED توانست انواع مختلف این رونوشتها را شناسایی کند. در این آزمایش، سه نمونه که با RT-qPCR منفی گزارش شده بودند، با HOMEBRED مثبت تشخیص داده شدند و دو بیمار نیز دارای هر دو رونوشت e13a2 و e14a2 بودند.
البته پژوهشگران در این بخش از نسخه تکمرحلهای سامانه برای نمونههای بالینی استفاده نکردند و ارزیابی آن را به ردههای سلولی مثبت از نظر BCR-ABL1 محدود کردند؛ زیرا شناسایی دقیق رونوشتهای سرطانزا در نمونههای بیماران به حساسیت و دقت بالایی نیاز دارد.
یکی از نکات مهم مطالعه این است که نسخه تکمرحلهای HOMEBRED، با وجود سادهتر بودن فرآیند، در برخی آزمایشها حساسیت پایینتری نسبت به روش دومرحلهای نشان داد. در آزمایش مربوط به ویروس تب برفکی، روش تکمرحلهای تنها ۷۷ درصد تطابق با روش دومرحلهای داشت و سه نمونه مثبت را بهصورت کاذب منفی گزارش کرد. بررسی حد تشخیص نیز کاهش حساسیت این روش را نشان داد. به همین دلیل، نویسندگان خطر ایجاد نتایج منفی کاذب در روش تکمرحلهای را مورد تأکید قرار دادهاند.
در مقابل، روش دومرحلهای همراه با آمادهسازی نمونه به کمک HUDSON، عملکرد مناسبی را در تشخیص نمونههای حیوانی نشان داد و امکان استفاده از خوانش رنگسنجی یا فلورسنت را فراهم کرد. یکی از گزینههای پیشنهادی مقاله برای افزایش قابلیت استفاده میدانی این سامانه در آینده، توسعه معرفهای خشکشده و پایدارشده است.
در مجموع، پژوهشگران HOMEBRED را یک پلتفرم تشخیصی چندمنظوره معرفی کردهاند که میتواند برای شناسایی عوامل عفونی انسانی و حیوانی و همچنین برخی نشانگرهای سرطان به کار رود. قابلیت استفاده از نمونههای خام، نیاز کمتر به تجهیزات آزمایشگاهی و امکان خوانش بصری از ویژگیهایی است که از نظر نویسندگان میتواند این فناوری را برای استفاده در محیطهای میدانی و مناطق دارای محدودیت زیرساختی مناسب کند.
با این حال، مقاله بر ضرورت توسعه و اعتبارسنجی بیشتر این فناوری تأکید دارد. از جمله محدودیتهای مطالعه میتوان به دسترسی نداشتن به ایزولههای بالینی Brucella canis و محدودیت در ارزیابی برخی رونوشتهای BCR-ABL1 اشاره کرد. نویسندگان همچنین برای کاربرد گستردهتر این فناوری، توسعه معرفهای پایدار و بررسیهای بیشتر را پیشنهاد کردهاند.
یک نکته مهم برای انتشار ایسنا: من عمداً عبارتهایی مثل «تشخیص قطعی سرطان»، «جایگزین PCR» یا «تشخیص در چند دقیقه» را وارد خبر نکردم؛ چون مقاله چنین نتیجهای را بهصورت کلی اثبات نکرده است. بهویژه درباره نسخه تکمرحلهای، خود مقاله کاهش حساسیت و ۷۷ درصد تطابق در آزمون تب برفکی را گزارش کرده است، بنابراین بهتر است خبر این محدودیت را هم منعکس کند.